以拟南芥AtRAN1基因为例进行oligo实操设计

（1）您可以通过以下在线工具设计：

CRISPR Design：http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR

（2）选取

atttttcagGCTCTACCTAACCAGCAAACCGTAGATTATCCCAGCTTCAAGCTTGTCATTGTTGGTGATGGAGGCACAGgtacggt

（3）输入序列信息（以拟南AtRAN1基因为例）

（4）点submit，出现右侧结果；

（5）根据左边不同Guide序列score的高低选取合适的Guide序列，score的高低并不代表敲除效率的高低，所以为提高敲除的成功率，一般选择2-3个Guide序列，构建2-3个敲除载体。

文献资料

1.Jinek, M., Chylinski, K.,Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., and Charpentie E. A programmabledual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptiv bacterial immunity. Science,2012,337: 816～821.

2.Xie K, Yang Y.RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. MolPlant. 2013 Nov;6(6):1975-83.

3.Nekrasov etal. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol. 2013 Aug 8;31(8):691-3. doi:10.1038/nbt.2655. PubMed

4.Horvath P.,Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science,2010, 327 (5962): 167～170.

5.Hale CR, Zhao P., Olson S.,et al. RNA-Guided RNA Cleavage by a CRISPR RNA-Cas Protein Complex. Cell, 2009,139 (5): 945～956.

6.Zhang F., et al. MultiplexGenome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science , 2013, 339(6121): 819～823

7.Westra ER., Swarts DC.,Staals RH., Jore MM., Brouns SJ., van der Oost J. The CRISPRs, they area-changin': how prokaryotes generate adaptive immunity. Annu Rev Genet, 2012,46: 311～339.

8.Marraffini LA., SontheimerEJ. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria andarchaea. Nature Rev Genet, 2010, 11 (3): 181～190.

9.Jiang, W., Bikard, D., Cox,D., Zhang, F., and Marraffini, L.A. RNA-guided editing of bacterial genomesusing CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology, 2013, 31: 233～239.

10.Hwang WY., Fu Y., Reyon D.,Maeder ML., Tsai SQ., Sander JD., Peterson RT., Yeh JR., Joung JK. Efficientgenome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology,2013, 31:227～229

11.Barrangou R. RNA events.Cas9 targeting and the CRISPR revolution. Science. 2014, 344(6185):707～708.

12.Nishimasu H., et al. Crystalstructure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell, 2014,156(5)935～949.

GP0143,GP0144-pP1C系列植物敲除试剂盒说明书.pdf

Q&A

Q-1：在进行植株的敲除载体构建前，还需要做哪些准备工作？

A-1：需要目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要 PCR 扩增靶基因，并对 PCR 结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用 RT-PCR 分析靶基因的活跃度。

Q-2：植物敲除试剂盒中的质粒能否在大肠杆菌中复制扩增？若将载体构建交予你们做，怎么收费？

A-2：试剂盒中的质粒能够在大肠杆菌中复制扩增，若您希望长期使用该质粒，建议在收到货后即转化至大肠杆菌中以利于长期保存和使用。敲除载体构建服务我们的收费标准是1800元/个，完成后仅提供构建完成的敲除载体和测序结果，而不提供构建的原载体以及中间载体。因敲除载体构建的特殊性，我们仅对构建的载体负责，不保证最终的敲除效果；一般的，我们建议设计2~3个不同的靶点对目的基因进行敲除。若您预期长期使用CRISPR/Cas9技术进行基因组编辑，我们推荐能购买试剂盒产品。